并改善能够减缓细胞衰老的许多存活基因和功能

　　并改善能够减缓细胞衰老的许多存活基因和功能fx外汇平台衰总是一个弗成避免又众数存正在的人命历程 [1] ， 也是一个由众种生物和遗传途径调控的丰富的心理历程 [2] 。衰老直接影响机体寿命，激发简直总共年岁干系疾病，首要席卷免疫体系疾病、神经退行性疾病、血汗管疾病、肌肉骨骼疾病和癌症等 [2] 。寻找靶向衰老机制和改观健壮拉长寿命的药物已成为该范围的商量热门 [2] 。细胞衰总是衰老的一个厉重特点，可分为复制性衰老（ reproductive senescence ，RS ）、应激诱导的早衰（stress-induced premature senescence ，SIPS ）、胚胎发育历程中发作的步骤性衰老（programmed senescence ，PS ）、癌基因诱导的衰老（oncogene-induced senescence ，OIS ）和调养诱导的癌细胞衰老（treatment induces cancer cellular senescence ，TIS ）等[3] 。体外实践平日采用一口气传代的RS 细胞和药物刺激导致的SIPS 细胞[3-4] 。RS 历程相对徐徐，以是常用诱导SIPS 的方法加快细胞衰老，此中H2O2 是最常用的SIPS 诱导剂之一，对众种细胞衰老都有用[5] ，以是被选作本实践的细胞衰老诱导剂举办氧化应激诱导的衰老商量。

　　肃静调整卵白 1 （Sirtuin 1 ，SIRT1 ）能够通过强迫氧化应激、裁汰炎症响应和克复线粒体性能阻滞等，调养衰老干系疾病，被普遍商量为减轻衰老诱导的疾病的潜正在调养靶点[6-7] 。正在氧化应激历程中，SIRT1/ 信号转导和转录激活卵白3 （signal transducer and activator of transcription 3 ，STAT3 ）信号通道施展着厉重的影响，调整细胞的增殖和凋亡[8-10] 。以是揣测H2O2 诱导的衰老机制不妨与SIRT1/STAT3 信号通道相闭。另外，血小板活化因子受体（platelet activating factor receptor ，PAFR ）也是参加氧化应激的一个厉重靶点，拮抗PAFR 能够强迫血小板集合，减轻炎症、氧化应激和细胞凋亡[11] ，同样具有厉重的商量价钱。商量呈现，PAFR 与SIRT1 具有反向干系性[12-13] ，这预示着拮抗PAFR 不妨通过调整SIRT1 来减轻衰老。神经养分素是一种卵白质家族，能够鼓舞神经元存活，改观突触性能和神经递质开释，并鼓舞中枢和外周神经体系内轴突的可塑性和成长，常睹于神经毁伤的商量[14] 。据报道，SIRT1 能够激活脑源性神经养分因子（brain-derived neurotrophic factor ，BDNF ），鼓舞神经元成长和毁伤修复[15] 。以是本商量还检测了BDNF 以及与其性能相同的神经养分因子3 （neurotrophin 3 ，NT3 ）。这2 种神经养分因子常正在神经毁伤商量共同检测[16] 。

　　中医药因其滋补保健且无吃紧不良响应的特质，正在抗衰老商量中越来越受到珍贵。商量报道，具有抗氧化活性的中药自然产品能够通过一系列信号体系防治氧化应激和氧化还向来源的应激源诱发的众种疾病（席卷衰老），并改观或许减缓细胞衰老的很众存活基因和性能，施展其抗衰老影响 [17] 。银杏二萜内酯（ginkgo diterpene lactone ，GDL ）打针液是邦际上首个以PAFR 为靶点的上市更始中药，首要由银杏内酯A （ginkgolide A ，GA ）、银杏内酯B （ginkgolide B ，GB ）、银杏内酯K （ginkgolide K ，GK ）构成，或许强迫血小板集合和氧自正在基，常用于调养脑缺血再灌注毁伤[18] ，具有活血通络的成效[19] 。固然GDL 常用于商量氧化应激的病理毁伤[20] ，其拮抗PAFR 正在调养神经退行性疾病中也有清楚的功效[21] ，但邦外里暂未报道其正在抗衰老中的 影响，以是揣测GDL 不妨成为一种潜正在的具有强迫氧化应激诱导的衰老的药物。本商量讨论GDL 是否具有拮抗氧化应激诱导的神经元衰老的影响，并进一步商量其影响的机制，以拓展GDL 的其他药用价钱。

　　PC12 细胞苏醒后，用含10% FBS 的DMEM 造就基造就。待细胞长满80% ，弃去造就液，参加PBS 轻轻荡洗，弃去荡洗液，参加胰酶，消化细胞，弃去消化液，并参加含10% FBS 的DMEM 造就基终止消化，离心弃上清，参加含10% FBS 、1% 青霉素和链霉素的DMEM 造就基，轻轻奏乐成单细胞悬液，传代于新的造就皿中，于37 ℃、5% CO2 造就箱中造就，每2 天调换1 次造就液，取对数成长期的PC12 细胞用于实践。

　　取对数成长期的 PC12 细胞，以2 ×105 个/mL 接种于96 孔板，待细胞一律贴壁后，用0 ～600 μmol/L H2O2 打点24 h ，或正在300 μmol/L H2O2 打点前3 h 参加0 ～100 μg/mL GDL ，对比组为不含药物的造就基，随后各孔调换簇新造就基并参加10 μL CCK-8 事业液，正在37 ℃造就箱中避光孵育4 h 。用酶标仪正在450 nm 处测定吸光度（A ）值，揣度细胞存活率。

　　取对数成长期的 PC12 细胞，以2 ×105 个/mL 接种于24 孔板的爬片上，待细胞贴壁后，用300 μmol/L H2O2 打点24 h ，或正在300 μmol/L H2O2 打点前3 h 参加30 μmol/L PAF 强迫剂WEB-2086 或50 μg/mL GDL ，另修立不含药物的对比组。给药解散后用PBS 洗涤爬片3 次，用试剂盒中的固定液常温孵育15 min ，然后正在37 ℃的染色溶液中孵育24 h 。结果，用PBS 洗涤3 次，笼盖载玻片后用正置显微镜直接成像，用Image J 软件领会，揣度β- 半乳糖苷酶阳性细胞率。

　　取对数成长期的 PC12 细胞，以2 ×105 个/mL 接种于24 孔板的爬片上，待细胞贴壁后，用300 μmol/L H2O2 打点24 h ，或正在300 μmol/L H2O2 打点前3 h 参加50 μg/mL GDL ，另修立不含药物的对比组。给药解散后用PBS 洗涤爬片3 次，用4% 众聚甲醛常温孵育15 min ，随后用PBS 洗刷3 次，结果直接用DAPI 染料举办染色，室温孵育5 min 。结果，用PBS 洗涤样品3 次，笼盖载玻片后用50% 甘油封片。正在荧光显微镜下直接成像，用Image J 软件举办领会，揣度均匀细胞核体积。

　　取对数成长期的 PC12 细胞，以6 ×105 个/mL 接种于造就皿中，待细胞贴壁后，用300 μmol/L H2O2 打点24 h ，或正在300 μmol/L H2O2 打点前3 h 参加30 μmol/L PAF 强迫剂WEB-2086 或50 μg/mL GDL ，另修立不含药物的对比组。给药解散后参加细胞裂解液，于冰上裂解30 min ，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min ，取上清液，测定卵白含量。参加5 ×SDS-PAGE 卵白上样缓冲液，卵白变性后，卵白样品经10% 或12% 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，孵育对应的一抗止宿，然后孵育二抗，运用BeyoECL Moon 巩固化学发光试剂盒显影，采用凝胶成像仪、Quantity One 软件举办可视化，Image J 软件领会宗旨条带灰度值。

　　数据打点采用 GraphPad prism 8.0.2 软件，所少睹据以 透露。采用Students’t 检讨两组间的数据斗劲，当3 组或3 组以上斗劲时用独身分方差领会后，采用Dunnett’s 检讨。

　　3.3.1 GDL 给药条目 正在H2O2 打点前予以区别质地浓度GDL 干与3 h ，随后再与H2O2 合伙打点细胞24 h ，细胞生气闪现区别水准克复（图3 ），与模子组斗劲，50 μg/mL GDL 明显上调细胞生气（P ＜0.05 ）。以是后续实践GDL 质地浓度挑选50 μg/mL ，预给药3 h 后一直给药24 h 。

　　3.5.1 GDL 强迫PC12 神经元的凋亡 SIRT1/ STAT3 信号通道的激活能够诱导细胞凋亡。用TUNEL 染色法检测细胞凋亡，如图6 所示，与对比组斗劲，模子组凋亡细胞数目增加（P ＜0.01 ）；与 模子组斗劲， GDL 组凋亡细胞数目显然裁汰（P ＜0.05 ），提示GDL 强迫氧化应激惹起的细胞凋亡。

　　3.5.2 GDL 鼓舞神经养分因子的排泄 神经养分因子能够鼓舞神经元的成长和毁伤修复，正在神经元的成长历程中起珍惜影响。如图7 所示，与对比组斗劲，模子组BDNF 和NT3 卵白外达秤谌下降（P ＜0.05 ）；与模子组斗劲，GDL 能够明显上调BDNF 和NT3 的外达（P ＜0.05 ）；各组NGF 无显然变革。

　　衰老的首要特点之一是细胞衰老，是一种对区别毁伤刺激做出响应的恒久性细胞周期勾留形态。衰老细胞的太甚蕴蓄堆积会对再生材干变成负面影响，鼓舞衰老干系疾病的产生并发扬促炎处境 [22] 。与平常细胞比拟，衰老细胞能够涌现出更众的衰老特点：正在细胞样式学上，细胞体积增大且形式不规定[23] ，成长正在固体外观时显然扁平，细胞核增大、形式不规定和异染色质集合[24] 。其次，衰老细胞还具有细胞周期阻滞的特质，其特点是p16 、p21 、p53 卵白象征扩展[23,25-26] 。同时衰老细胞磷酸化视网膜母细胞瘤卵白裁汰，半胱氨酸天冬氨酸卵白酶-3 （cystein-asparate protease-3 ，Caspase-3 ）卵白外达升高[27] 、核膜组织卵白Lamin B1 裁汰导致核完备性和牢固性降低，继而导致其他核变革[4] ；而且衰老细胞pH 依赖的β- 半乳糖苷酶活性也会扩展。H2O2 平日被举动诱导氧化应激的条目，现已被呈现其可使细胞露出出衰老的众数特点，已被普遍用于制备细胞衰老模子[28-30] 。本实践结果显示，细胞颠末H2O2 打点后β- 半乳糖苷酶染色率、细胞核体积及p21 、p53 外达扩展，同时Lamin B1 外达下降，说明胜利构修了H2O2 诱导的PC12 细胞衰老模子。而GDL 的干与可有用下降模子组β- 半乳糖苷酶阳性细胞率，下调p21 、p53 并上调LaminB1 的外达，强迫细胞核体积的增大。GDL 具有抗氧化应激诱导的PC12 神经元衰老的影响。

　　SIRT1 参加细胞调整衰老和老化的历程，是一个抗衰老的厉重靶点[31-32] 。不单如许，SIRT1 还参加氧化应激历程，此中SIRT1/STAT3 信号通道调控细胞增殖和凋亡，已被普遍使用于氧化应激病理商量。另一个调整氧化应激厉重的靶点PAFR ，已被呈现可被SIRT1 下调，强迫氧化应激，戒备PAFR 惹起的干系疾病[13-14] 。本商量呈现，血小板活化因子拮抗剂强迫剂WEB-2086 能够明显扩展SIRT1 的外达；H2O2 激活PAFR 后能够强迫SIRT1 的外达。以是正在PAFR/SIRT1 通道中，PAFR 也不妨位于上逛，调整SIRT1 卵白。以是H2O2 诱导的氧化应激衰老历程，不妨与SIRT1/STAT3 信号通道相闭，并受PAFR 的调控。

　　衰老细胞仍具有活性，平常以为其对凋亡有拒抗力，它们的代谢与自噬调整亲昵干系。纵然如许，仍有少数氧化应激诱导早衰的商量呈现，细胞衰老露出出凋亡的特点 [33] 。据报道，下调SIRT1 能够鼓舞STAT3 的磷酸化[34] ，随后STAT3 信号的传导激活下逛的p53 ，诱导细胞衰老、鼓舞凋亡[35] 。这与本实践结果类似，H2O2 诱导的神经元衰老能够激活p53 的外达，扩展TUNEL 凋亡染色。而GDL 的干与能够逆转这一征象，强迫PC12 细胞的凋亡。

　　神经养分因子是一种能够鼓舞神经元成长、珍惜神经元的卵白家族。除了参加氧化应激的 SIRT1/ STAT3 信号通道外，SIRT1/BDNF 信号通道[16] 也参加了本实践PC12 细胞的衰老历程。除了BDNF ，本商量还检测了常用于同时检测的NT3 和NGF 的外达。结果呈现，正在PC12 细胞的衰老历程中，GDL 能够鼓舞BDNF 和NT3 的排泄，对神经元起到珍惜影响，但NGF 不参加此历程。

　　综上， GDL 能够鼓舞神经养分因子的排泄，减轻神经元凋亡，具有延缓氧化应激诱导的细胞衰老的影响，其机制不妨与调控PAFR 和SIRT1/STAT3 信号通道相闭。本商量揣测了PAFR 与SIRT1/STAT3 信号通道和氧化应激诱导的细胞衰老之间的闭连，验证了GDL 正在氧化应激诱导的细胞衰老中的影响，为自然药物正在抗衰老的使用中供给了新的观点，为拓展GDL 的药用价钱供给了外面和实践凭借。然而，本商量仅举办了体外实践，缺乏体内商量，下一步将设立修设动物实践模子，进一步确认PAFR 与衰老的闭连以及GDL 的抗衰老影响。

　　来 源：杜雨芯，操娇娇，张倩霞，杨颖博，吴 伟，肖保邦，肖 伟． 银杏二萜内酯通过拮抗PAFR和调整SIRT1/STAT3强迫氧化应激诱导的PC12神经元衰老商量 [J]. 中草药, 2023, 54(9):2793-2891.

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